| Chaperone Competent Cell BL21 Series是由五種分別轉(zhuǎn)化一種伴侶蛋白質(zhì)粒 (Chaperone Plasmid Set (Code No.: 3340)) 的Escerichia coli BL21制成的感受態(tài)細(xì)胞。眾所周知，分子伴侶參與蛋白質(zhì)折疊過程，且人們已經(jīng)通過大量的實(shí)驗(yàn)研究來表明體內(nèi)蛋白折疊機(jī)理。 本制品中含有五種類型的質(zhì)粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16)，每一種質(zhì)粒都是能有效表達(dá)一組協(xié)同作用、共同參與蛋白折疊的被稱作“Chaperone team”的分子伴侶。靶蛋白與其中一種“Chaperone team”共同表達(dá)，便可增加可溶性蛋白質(zhì)的回收比率，而用通常方法，由于包涵體的形成，這些表達(dá)蛋白質(zhì)常常是不可回收的。E.coli BL21來源于B株，為L(zhǎng)on蛋白水解酶、ompT外膜蛋白水解酶缺陷型。因此，表達(dá)的外源蛋白質(zhì)在該體系中有更高的穩(wěn)定性。當(dāng)進(jìn)行靶蛋白與“Chaperone team”共表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常需要三步：1. 用伴侶蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主E.coli； 2. 用轉(zhuǎn)化體制備感受態(tài)細(xì)胞；3. 用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并表達(dá)靶蛋白。如果使用本產(chǎn)品，只需一步轉(zhuǎn)化就可構(gòu)建靶蛋白與“Chaperone team”的共表達(dá)體系，因?yàn)槭褂玫腅.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞已轉(zhuǎn)化有一種伴侶蛋白質(zhì)粒。另外，此感受態(tài)細(xì)胞有五種質(zhì)粒，不含有伴侶蛋白質(zhì)粒的TaKaRa Competent BL21也可作為對(duì)照。每種E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞包括一種伴侶蛋白質(zhì)粒，非常適合pCold DNA系列的表達(dá)。但該產(chǎn)品不適合于啟動(dòng)子為T7的蛋白質(zhì)表達(dá)體系，如pET系列，因?yàn)?，宿主E.coli BL21菌株不表達(dá)T7 RNA聚合酶。注意：本產(chǎn)品不可用于電擊法轉(zhuǎn)化。 ■ DNA序列 pG-KJE8 DNA (Fasta形式的txt文件) pGRO7 DNA (Fasta形式的txt文件) pG-TF2 DNA (Fasta形式的txt文件) pKJE7 DNA (Fasta形式的txt文件) pTf16 DNA (Fasta形式的txt文件) ■ 保存-80℃。注意：如果不是-80℃保存，轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低。此時(shí)，可在使用前用附帶的pUC19做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)轉(zhuǎn)化效率。不能保存在液氮中。 ■ 轉(zhuǎn)化效率Chaperone competent cells：轉(zhuǎn)化1 ng pUC19，涂于Cm+和Amp+平板上進(jìn)行篩選。TaKaRa competent cell BL21：轉(zhuǎn)化1 ng pUC19，涂于Amp+平板上進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化效率≥1×106 cfu/μg pUC19 ■ GenotypeE.coli BL21 : F-, ompT, hsdSB (rB-mB-), gal, dcm ■ 注意事項(xiàng)1. 從-80℃中只取出實(shí)驗(yàn)所用的感受態(tài)細(xì)胞，然后立即放入干冰/EtOH bath。開始實(shí)驗(yàn)前不要取出。2. 可使用1.5 ml microtube替代FALCON tube，但可能會(huì)降低效率。3. 使用100 μl感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，高純度DNA使用量不要超過10 ng，否則轉(zhuǎn)化效率會(huì)降低。4. 轉(zhuǎn)化體系改變 (如感受態(tài)細(xì)胞使用量發(fā)生改變) ,或換用了其它tube等，需研討轉(zhuǎn)化條件 (如使用一般的1.5 ml tube時(shí)，請(qǐng)于42℃保溫60秒)。5. 除SOC培養(yǎng)基外，L-broth及φb-broth也可使用，但轉(zhuǎn)化效率會(huì)有所下降。6. 稀釋時(shí)，使用SOC培養(yǎng)基。7. L-broth plate :成份per liter Tryptone10 g Yeast extract5 g NaCl5 g 用1N NaOH調(diào)整到pH7.5，添加agar到1.5%，高壓滅菌。8. 不建議將解凍的感受態(tài)細(xì)胞再次冷凍保存。如果再次凍結(jié)不可避免，將細(xì)胞置于干冰/乙醇中迅速冷凍，置于-80℃保存。但是，轉(zhuǎn)化效率可能會(huì)降低至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。9. 本制品中含有的伴侶蛋白質(zhì)粒帶有來源于pACYC的復(fù)制起點(diǎn)和氯霉素抗性基因 (Cmr)，E.coli表達(dá)系統(tǒng)中可以使用常用的ColE1型、具氨芐抗性 (Ampr)篩選標(biāo)記的表達(dá)載體，但不可與含有氯霉素抗性基因的表達(dá)質(zhì)粒共同使用。 |
