| 本系列制品是基于Gubler and Hoffman方法 (Gene (1983) 25:263-269)， 由各種Poly(A)+ RNA制作的質(zhì)粒DNA型cDNA文庫。合成cDNA片段時(shí)，使用了含有限制酶Not I位點(diǎn)的Oligo (dT)18 Linker Primer和BamH I (Bgl II)-Sma I 接頭，通過這兩個(gè)限制酶位點(diǎn)，使cDNA片段定向克隆到載體中?？寺∏?，做了短片段的分離處理，300 bp以下的片段大部分被去除掉。初級文庫構(gòu)建完成后，采用了固體平板培養(yǎng)法，僅對初級文庫進(jìn)行一次擴(kuò)增，然后使用質(zhì)粒提取試劑盒，從擴(kuò)增文庫的菌體中提取質(zhì)粒，調(diào)整得到擴(kuò)增的質(zhì)粒cDNA文庫。使用這種方法得到的擴(kuò)增文庫，盡可能保持了各種cDNA片段的克隆在初級文庫中所占的比例。 ■ 保存-20℃。 ■ cDNA文庫使用的載體和多克隆位點(diǎn)本cDNA文庫制品使用的載體為pAP3neo，含有SV40啟動子，可以在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。同時(shí)，該載體含有ssDNA生成的必要f1 ori、也含有便于RNA合成的T7及T3 RNA聚合酶啟動子。GenBank Accession No.AB0034681. cDNA片段克隆在pAP3neo載體的Bgl II位點(diǎn)和Not I位點(diǎn)之間。* 由于cDNA片段合成時(shí)，使用了BamH I (Bgl II)-Sma I接頭，克隆后，載體的Bgl II 位點(diǎn)失效，不能再被Bgl II酶切開。2. Xba I 位點(diǎn)受dam methylase的影響。 ■ 用途對未知或已知的cDNA進(jìn)行PCR篩選。 |
